تشخیص بیماری لوک امریکایی

بیماری لوک آمریکاییAmerican Foulbrood (AFB)  به نظر میرسە كه لوك امريكايي بایستی از زمان های باستان شناخته شده باشە.ارسطو اين بيماری رو توصيف کردە، وی اين بيماری رو بدليل رنگ لاروها، زنگ زدگی، نامیدە.  تا سالهاي 1900 به اشتباه تصور ميكردن كه بين رطوبت و ايجاد بيماری، يە ارتباط وجود دارە.
در سال 1885 احتمال دخالت باكتری تو اين بيماري مطرح شد، به دنبال اون در سال 1904 وايت اين ميكرب رو کشف كرد و نام بيماری حاصله از اون رو لوك آمريكايی گذاشت. این باکتری فقط بوسیله یە میکروسکوپ با قدرت بالا قابل مشاهده هستش.  منشاء جغرافیایی لوک آمریکایی ناشناخته هستش، اما تقریبا در سراسر جهان پیدا میشە. بیماری لوک آمریکایی یکی از مهمترین بیماری‌های زنبورعسل تو سطح دنیاست.این بیماری بسیار مسری هستش، بطوری که اگە کنترل نشە، میتونە کل زنبورستان رو نابود کنە. لوك آمريكايي يە بيماریە كه فقط لاروهای زنبورعسل Apis mellifera و سایر گونه‌های آپیس رو آلوده میکنە و سبب مرگ اونا میشە. اين بيماري يكي از خطرناكترين بيماريهاي نوزادان زنبورعسل هستش كه در سراسر دنيا گسترش دارە.

عامل ایجاد بیماری لوک آمریکایی
عامل ایجاد بیماری لوک آمریکایی ( AFB ) نوعی باکتری بنام Paenibacillus larvae subsp می‌باشد که از این پس به اختصار P. larvae نامیده می‌شود. باکتری P. larvae به شکل میله‌ای باریک و بلند با انتهای کمی گرد هستش و تمایل به رشد زنجیره‌ای دارە طول میله‌ها از 2/5 تا 5 میکرومتر بوده و عرض آنها 0/5 میکرومتر می‌باشد و تو اطراف اون يە مجموعه تاژك قرار دارە حدود 30 تا 35 تاژك متحرك دارە. با اين وجود تحرك اون ضعيف هستش. باكتري پس از ورود به بدن لارو رشد و تكثير میکنە تا زمانيكه شرايط تكثير محدود بشە. يا اینکە در صورت مواجهه با عوامل محدود كننده دیگە، باكتري تغییر شکل دادە و كوتاه و ميله‌ای شكل میشە، تاژكهاي خودش رو از دست میدە و در مركز يا نزديك انتها، هاگدار میشە كه فرم مقاوم باكتری هستش. اين اسپور يا هاگ تو لبه‌های خودش داراي توازن نيست و اندازه اون 0/5 در 1/5 ميكرون هستش.
با ميكروسكوپ چشمی، بنظر خالي میرسە، چون با رنگ آميزي، داخل اون رنگ نگرفته ولی خارج اون رنگ میگیرە. بعد زمانيكه شرايط مناسب باشە، در عرض 24 تا 48 ساعت هاگ تغيير شكل داده و ازش یە باسيل متولد میشە . سپس باسيل‌ها (به طريق تقسيم دوتايي) تكثير میشن و زیاد میشن. باسيل‌هایی كه میخوان تقسيم بشن خيلي از باسيل‌ها دیگە کوتاهترن. اسپور باکتری بیضی شکلە و طول اون 2 برابر عرضشە . اين باكتری تو شرايط مناسب برا تكثير به شكل ميله‌ای ( باسيل ) و تو شرايط نامناسب به شكل مقاوم ( اسپور ) در میاد.

A : سلولهای رویشی باکتری P.larvae
B : تشکیل اسپورهای باکتری P.larvae     
C : اسپورهای  باکتری P.larva

نحوه عمل
اسپورها پس از ورود به دستگاه گوارشی لارو، تو معده گوارشی پس از حدود یە روز جوانه میزنن.سپس از راه دیواره معده گوارشی به ‌داخل همولنف نفوذ کرده و اونجا تکثیر پیدا میکنن. بهترین شرایط برا جوانه زدن اسپور، کم بودن مقدار اکسیژن تو محیط هستش و این شرایط تو معده گوارشی وجود دارە.  پس از جوانه زدن اسپور داخل معده گوارشی، بایستی حالت رویشی ایجاد بشە و حالت رویشی خود تولید مجدد اسپور میکنە. تشکیل حالت رویشی و تولید اسپور تو محیطی مناسب‌ترە که اکسیژن به اندازه کافی وجود داشتە باشە ، بنابراین حالت رویشی قادر به تکثیر در داخل معده گوارشی لارو نیست و این عمل داخل همولنف انجام میشە. باکتریها ضمن تغذیه از محتویات بدن لارو موجب چرکی شدن قسمتهای داخلی بدن اونا میشە.

گسترش بيماري
دوستان عزیز دقت داشتە باشین کە اسپورهايي كه به لوله گوارشی لارو برسن عامل ايجاد بيماری قلمداد میشن.  تعداد اسپوری كه لازمە تا ايجاد بيماري کنە خيلي متفاوتە.  میتونە خيلي كم باشە يا خيلي زياد.مؤلفان از تعداد 35 عدد اسپور تا 50 ميليون اسپور رو ذكر کردەاند.  اين تفاوت در هنگام آلودگي تجربي بسته به سن لارو، مقاومت كلني در مقابل عامل بيماري،  توانايي تكثير عامل بيماريزا و يا  از دست دادن قدرت بيماريزايي و دريافت عامل بيماري توسط لارو فرق میکنە.
باسيل بيماری، زمانی بيماريزا هستش که مستقيما داخل همولنف تزريق بشە.  باید توجه نمود که P. larvae زنبورا رو فقط تو مرحله لاروی مبتلا میکنە. لاروهاي كمتر از 24 ساعت بالاترين حساسيت رو دارن.  بنظر میرسە کە  بعد از دو روز كاملا مقاومت ايجاد میشە.  لاروهای مسن نياز به ميزان بالایی از  اسپور دارن تا آلودگي  تو اونا شروع بشە. ايمني طبيعي لاروها ضعيفە.  بعد از آلودگي، اسپورها داخل روده باز شده و باسيل آزاد میشە.  اما باسيلها تو اين محل بطور محدود تكثير پیدا میکنن.

اين ممانعت مقطعی میتونە به دلايل زير باشە
1 - وجود قندهای فروكتوز و گلوكز تو روده لارو.
2 - وجود اسيد در روده، كه منشاء اون ژله رويالە و نقش آنتي بيوتيكی دارە. كيفيت ژله رويال نيز بستگي به گرده دارە. گرده‌هايی كه نقش آنتي بيوتيكي دارن، بسته به منشأ گل و طول دوره ذخيره سازي متفاوتن. در واقع كيفيت گرده‌ای كه تو تغذيه لارو بكار میرە نقش اصلي رو تو جلوگيري از رشد آلودگي بازي میکنە.آلودگي صورت گرفته در لارو جوان تمام بدن لارو رو مبتلا میکنە. ولي علايم ابتدا ظاهر نمیشن، بلكه با تغيير سوخت و ساز لارو، در زمان شفيره‌اي با از بين بردن بافت روده و عبور از سد آن، بروز میکنە. باکتری سريعا در داخل همولنف تكثير و عفونت عمومي رو ايجاد میکنە.

علايم بیماری
علايم لوك آمريكايی ەو شفيره‌های در بسته تشخيص رو برا زنبوردار سخت میکنە.  یە لارو سالم داری ظاهری براق و سفید مرواریدی هستش.  لارو سالم در ابتدا تو ته سلول به شکل حرف C رشد و نمو میکنە اما رشد بعدی اون باعث پر شدن سلول به سمت بالا میشە کە تو تصویر زیر نشون دادیم.  لارو عفونی تو این مرحله که ممکنە بصورت قائم یا عمودی هم قرار بگیرە میمیرە. 

تصویر لاروهای آلوده به باکتری P. larva ( لاروها در حال تغییر رنگ و تلف شدن هستند )        لارو سالم زنبورعسل » (A): برش عمودی شان ««»» (B): شمای لاروها از بالای شان

روشهای تشخیص بیماری
1 - شفیره‌های موزاییک مانند
2 - فرورفتگي درب حجره‌ها
3 - بوي آمونياك شديد
4 - لاروهاي كشدار
5 - لارو خميري
5 - حالت زبان لاروی
7 - پلاك هاي لوك آمریکایی

موارد فهرستی بالا روشهایی هستن کە تو ادامە مطلب درمورد بیماری لوک آمریکایی خدمت شما عزیزان توضیح دادە خواهد شد.
1 - شفیره‌های موزاییک مانند « به اين صورت كه تو يه كادر حجره‌های شفيره نامنظم در كنار لاروهای جوان در سنين مختلف مشاهده میشە.  اين حالت بدليل حذف نوزادان تلف شده توسط زنبوران نظافت‌گر و جايگزين شدن اونا با تخمهای جديد ايجاد میشە.  البته این صفت مختص لوک آمریکایی نیستش.

تصویر شفيره‌هاي موزاييك مانند ( جاهای خالی در بین شفیره‌های سربسته )

2 - فرورفتگي درب حجره‌ها » درب حجره‌ها فرورفتگی پيدا كرده و اغلب سوراخ میشە يا توسط زنبورایی كه تو جستجوی لاروهای مريض هستن تا اونا رو حذف کنن جويده میشن، رنگ درب حجره‌ها معمولاً  قهوه‌ای متمايل به سياه میشە.

فرورفتگي درب حجره‌ها

3 - بوي آمونياك شديد « روش بعدی اینە کە بوی بسیار شدید آمونیاک از داخل کندو میاد مثل بوی چسبي كه تو قديم توسط مبل سازان مصرف میشد،  اين بو بدليل اسيدهای فرار هستش و در ابتدای بيماری از كادرها يا قابها و تو شرايط آلودگي شديد از سوراخ پرواز قابل درك هستش.
4 - لاروهای كشدار «لارو ها چسبيده به ديواره جانبی حجره، تشكيل يە توده قهوه‌ای متمايل به سياه رو میدە، دوستان، اين علامت آلودگی شديد به لوك آمريكايی هستش.  تو این مرحله اگە چوب كبريتی رو به داخل حجره فرو برده، كمی بپیچونیم و بيرون بكشيم، رشته كشدار تقريبا درازی حداقل به طول 2/5 سانتي متر به دنبال چوب كبريت كشيده خواهد شد كه يكی ازعلائم بسيار مشخص بيماری هستش. ( تست چوب کبریت )

تست چوب کبریت ( یکی از بارزترین نشانه های لوک آمریکایی کش آمدن لارو آلوده است )

5  - لارو خميري » لارو چسبناك كم كم خصوصيت كشدار بودن رو از دست داده و خشك میشە، داخل حجره زنبورعسل يە توده خميري مشاهده میشە.
6 - حالت زبان لاروی » بعضی از سلولهای حاوی شفیره‌های مرده، دارای یە باریکه نخی شکل قهوه‌ای هستش که به طرف بالای سلول کشیده شدە.  این باریکه نخی شکل همون زبان یا خرطوم شفیره هستش .
7 - پلاك هاي لوك آمریکایی « بعد از خشك شدن، لاروهای چسبناك به يە پوسته قهوه‌اي تبديل شده كه به ديواره حجره چسبيده و حاوي چيزي بجز اسپور نیست.  این پلاکها به سختی از ته حجره جدا میشن.  هر پلاك حاوي دو ميليارد و نيم اسپور هستش. در نظر اجمالي به كادرها، به سختي قابل رؤيت هستش ولي منبع شدید انتقال بيماري هستش.

نحوه انتشار بیماری
توجە داشتە باشین کە آلودگی کلنی زنبورعسل به باکتری و وجود بیماری، فصل معین و مشخصی ندارە.  بیماری در هر موقع از سال که تو کندو لارو وجود داشته باشە عارض میشە. راههای مختلفی برا سرایت بیماری وجود دارە کە از مهمترین اونا بە 10 مورد اشارە میکنیم.که سە تای اونا رو بە عرضتون میرسونیم.

1 - راه انتقال اول
در درجه اول خود زنبوردار با دست‌ها و وسايل كار آلوده به عامل بيماری و يا برداشتن قاب از كندوي بيمار و قرار دادن اون تو كندوهای سالم باعث انتشار لوك آمريكايی تو زنبورستان میشە.پس دقت زنبورداری و عاری بودن زنبوردار از هر نوع بیماری اساس کار یە زنبوردارە.

2 - راه انتقال دوم
بعضی اوقات قبل از پوشیده شدن سر سلولهای حاوی لارو آلوده، این سلول ها توسط زنبوران پرستار کشف و حدود 10 الی 40 درصد اونا خارج میشن.  اسپورهای باکتری تو بقایای نوزادان مرده در سلولها موجود بوده و به هر صورت به طرق مختلف بداخل عسل موجود تو کندو راه یافته و بعنوان منبع آلودگی باقی میمونن. تغذیه از عسل باقی مانده موجود در کلنی  بطور مستقیم یا از طریق افزودن آن به غذای لاروها و همچنین تبادل غذا بین اعضای کلنی موجب انتشار بیماری داخل کلنی میشە ، تبادل غذا در بین زنبوران کارگر که در انتقال و انتشار باکتری تاثیر بسزایی دارد..

3 - راه انتقال سوم
زنبورهاي وارداتي آلوده (ملکه های هیبرید آلوده) میتونن نقش بسیار مهمی تو انتشار بيماری داشته باشن.

4 -  راه انتقال چهارم
زنبورهایی كه حجره‌های آلوده رو تمیيز كرده‌اند یکی دیگە از راههای انتقال بیماری هستش و خیلی مستعد این انتقال هستن.

5 - راه انتقال پنجم
خرید و فروش زنبور، ملکه و وسایل زنبورداری خصوصا شان ( پوکه یا قاب استراکتور شده )  از منابع آلوده به بیماری مسلما باعث انتشار بیماری میشن.پس تو این نقل و انتقالات و خرید وسایلاتون خیلی دقت و وسواس کافی بە خرج بدین.

6 - راه انتقال ششم
زنبورای نری كه آزادانه به داخل تمامی کندوهای مجاور و کندوهای سایر زنبورستانها رفت و آمد میکنن موجب انتقال بيماری میشن.

 7 - راه انتقال هفتم
یکی دیگە از راههای مهم انتقال بیماری بە سایر زنبورستانها و کندوها استفاده از موم كندوهای بيمار برا ساختن موم پرچ شده هستش.خیلی دقت کنین کە عامل این بیماری از هر طریقی برای انتقال بیماری استفادە میکنە.

8 - راه انتقال هشتم
توجە داشتە باشین کەدر صورت ابتلای حتی یە کلنی به این بیماری خطرناک و عدم توجه زنبوردار به اون جهت انجام اقدامات لازم این کلنی بتدریج ضعیف شده بطوری که قادر به دفاع از خود نبوده و به زودی توسط زنبورهای سایر کلنی‌ها مورد غارتگری قرار میگیرە. غارت شدن کلنی بیمار باعث میشە که عامل بیماری از طریق عسل آلوده غارت شده به سرعت تو سایر کلنی‌های همون زنبورستان یا زنبورستانهای مجاور منتشر بشە و این خود منجر بە یە فاجعە میشە کە کنترل این بیماری رو بسیار بسیار سخت و در بعضی موارد غیر ممکن میکنە.

9 - راه انتقال نهم
بعد از مهاجرت در اثر ورود اشتباهي زنبورا به كندوهای مجاور در صورتي كه آلوده باشن میتونن كندوی جديد رو بە راحتی آلوده کنن.

10 - راه انتقال دهم
گرفتن بچه کندوی طبیعی یا مصنوعی از کلنی بیمارو ادغام کلنی بیمار با کلنی سالم قطعا تو افزایش منبع آلودگی و انتشار بیماری تاثیر بسزایی دارە.توجە داشتە باشین کە این 10 روش گفتە شدە در بالا از روشهای رایج انتقال این بیماری هستش کە بعضی از اونا واقعا در بعضی موارد غیر قابل کنترل توسط زنبوردار هستش.
بنابراین حتما همیشە در مواقع بررسی کلنی ها در صورت مشاهدە یک سری علایم بیماری در سریعترین زمان ممکن اقدام بە درمان کلنی و جدا کردن اون از سایر کلنی ها کردە و در صورت تایید شدن نهایی این نوع بیماری تو کندو در اسرع وقت کندو رو با تمامی زنبورها و وسایل منهدم و آتش بزنین.

روشهای تشخیص آزمایشگاهی
کشت باکتری :  Paenibacllus larvae برا رشد باکتری P. Larvaeمحلول اسپور لازم رو با مخلوط کردن مواد مرضی (3 تا 5 فلس) با 9 میلی لیتر آب استریل تو لوله دردار آلوده میکنیم ( از پنبه مرطوب برا برداشتن و انتقال فلس‌ها از شان به درون لوله استفاده میکنیم ) برا کشتن باکتریهای غیر اسپورزا محلول حاصله رو بمدت 10 دقیقه ( زمان موثر ) تو درجه حرارت 80 درجه سانتی گراد قرار میدیم. از یە سوآپ پنبه‌ای استریل یا پخش کننده L شکل برا پخش یکدست حدود 0/2 میلی‌لیتر از محلول بر روی سطح پلیت آگار BHIT استفاده میشە و سپس بمدت 2 ساعت تو درجه حرارت 43 درجه سانتی گراد قرار داده میشە. کلنی‌ها تک باکتریهای کوچک و کدر (1 -2 میلی متر) هستن و در عین حال اگە تعداد زیادی از اسپورهای  P. larvaeکشت شده باشن، سطح پلیت توسط لایه‌ای یکپارچه از کلنی‌های باکتری پوشیده خواهد شد.
در میان تمامی باکتریهای اسپورزا، تو زنبورعسل فقط پنی باسیلوس لاروا دارای حرکت براونی هستش.  لازم به ذکرە که P. larvae محیط های معمولی کشت باکتریها از جمله نوترینت آگار(Nutrient agar) برا رشد این باکتری مناسب نیستن. روشهای قابل اطمینانی برا شمارش (Plate counts) تعداد P. larvae وجود ندارە زیرا کمتر از 10 درصد از اسپورها تو محیط کشت ارائه شده موجود، رشد قابل مشاهده ای خواهند داشت. آڤای Shimanuki با کالیبره کردن روشهای ارائه شده،  بوسیله تعداد اسپورها و پلیتها تخمین زده می‌شود که حداقل 100 عدد اسپور P. larva   برای ایجاد رشد قابل مشاهده در محیط PHIT مورد نیاز است.
دقت داشتە باشین کە انجام روشهای تشخیص آزمایشگاهی بە مراتب سختر از اینە کە بخوایم خودمون انجام بدیم، در ضمن شاید امکانات اونو هم نداشتە باشیم. پس تو این جور موارد  بهترە کە این کار رو توسط خود افرادی کە تو آزمایشگاە هستن و امکانال و لوازم  کار رو دارن انجام بشە.پس بە محض دیدن موارد مشکوک آزمایشات لازم رو انجام بدین تا در سریعترین زمان ممکن اونو کنترل کنین.

حالا ما یە سری روشهای خیلی عالی و راحت رو بە شما معرفی میکنیم کە بتونین با اجرای این روشهای آزمایشی، خیلی راحت از سالم یا ناسالم بودن کندوهاتون بە بیماری لوک آمریکایی مطمئن بشین.
1 - روش تست شیر هولست (Holst milk tests)
2 - روش تست احیاء نیترات (Nitrate reduction)
3 - روش تست تولید کاتالاز (Catalase production)
4 - آنتی بادی فلورسنت (Florescent antibody)

اولین روش » روش تست شیر هولست  ( Holst milk tests )
تست شیر هولست یە آزمایش ساده بر اساس سطح بالای آنزیم‌های پروتئولیتیک تولید شده در مرحله اسپورزایی باکتری P.larva  هستش آزمایش با تعلیق یە فلسی کە فک میکنین آلودە یا مشکوک بە آلودگی یا یە گسترش از لارو بیمار تو یە لوله آزمایش محتوی 3 تا 4 میلی لیتر شیر خشک کم چرب یە درصد محلول تو آب انجام میشە. سپس لوله تو دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده میشە.در صورت حضور بیماری لوک آمریکایی، محلول در عرض 10 تا 20 دقیقه شفاف میشە

تست شیر هولست
 

دومین روش » روش تست احیاء نیترات  ( Nitrate reduction )
باکتری P. larvae نیترات رو به نیتریت تبدیل میکنه، آزمایش احیاء نیترات میتونە با اضافه کردن نیترات پتاسیم (1 تا 2 میلی‌گرم در هر لیتر از محیط کشت) به یە محیط کشت مانند BHIT انجام میپذیرە. پس از رشد باکتری اگە نیترات به نیتریت تبدیل شده باشە با اضافه کردن یە قطره اسید سولفانیلیک – آلفا – نفتول (Sulfanilic acid-alpha-naphthol) به محیط کشت رنگ قرمز ایجاد میشە. تشخیص باکتری نبایستی تنها بر اساس این تست صورت بگیرە، بلکه ترجیحا با توجه به علایم عمومی لاروها، مورفولوژی باکتری و خصوصیات رشد کلنی باکتری صورت میگیرە.

سومین روش » روش تست تولید کاتالاز ( Catalase production )
این روش بە این صورتە کە اول یە قطره از محلول پراکسید هیدروژن 3 درصد بر روی محیط کشت جامد در حال رشد قرار داده میشە. بیشتر باکتریهای هوازی، پروکسید رو به آب و اکسیژن تبدیل کرده و یە کف حبابدار تولید میکنن، ولی باکتری P. larvae هیچگاه این عکس العمل رو نشون نمیدە.

تولید کف حبابدار در تست تولید کاتالاز که باکتری P.larvae این کف رو تولید نمیکنە

چهارمین روش » روش آنتی بادی فلورسنت ( Florescent antibody )
این روش به تهیه آنتی بادی‌های اختصاصی که با رنگ فلورسنت رنگ آمیزی شده‌اند نیاز دارە. کشت خالص باکتری P. larvae رو به خرگوش تزریق کردە، آنتی سرم فعال رو جمع آوری نموده و با یە رنگ فلورسنت رنگ آمیزی میکنن.  این آنتی سرم فلورسنت با نمونه باکتری بر روی یە اسلاید مخلوط میشن و به اونا اجازه واکنش داده میشە. آنتی سرم اضافه رو از روی اسلاید شسته و سپس اسلاید بوسیله یە میکروسکوپ فلورسنس بررسی میشە.  باکتری P. larvae بصورت اجسام فلورسنس تو ضمینه تاریک مشاهده میشن.

باکتری P. larvae بصورت اجسام فلورسنس در ضمینه تاریک

جستجوی اسپور پنی باسیلوس لاروا در فرآورده‌های کندو شامل عسل، گردە و موم
اولین فرٱوردە کندو کە میخواییم بررسی کنیم عسل هستش ، برخی مواقع ممکنە بررسی عسل از نظر وجود P. larvae لازم باشە.  باتوجه به غلظت بالای هیدروکربنها و مواد طبیعی ضد رشد باکتری تو عسل آزمایش عسل، نیاز به تمهیدات ویژه‌ای دارە.

چند روش برای این کار وجود دارە کە بە شرح زیر هستش.
1 - روش رقیق سازی
2 - روش تلقیح مستقیم
3 - روش دیالیز کردن

اولین روش » جستجوی اسپور پنی باسیلوس لاروا توی عسل روش رقیق کردن هستش
روش کلاسیک  (1932-1936 ,Sturtevant) بدین صورت که عسل رو به نسبت 1 به 9 با آب رقیق میکنن، سپس محلول بایستی سانتریفیوژ بشە تا اسپورها ته‌نشین بشن و بعد اون رسوب حاصله بوسیله میکروسکوپ از نظر وجود اسپور مورد بررسی قرار گرفتە میشە. به هر حال نمایش قطعی وجود اسپور P. larvae تو عسل نیازمند تکنیک‌های رشد هستش.
هارنیتسکی و کلارک ( 1991 ) روش زیر را پیشنهاد  کردن 125 میلی لیتر از نمونه عسل رو با 25 میلی لیتر محلول نمک فسفاته (PH=7/2) رقیق میکنن و بمدت 45 دقیقه تو بطری 500 میلی لیتری با G3000  سانتریفوژ میکنن.  مایع رویی رو بردارین تا تقریبا 3 میلی لیتر از آب باقی بمونە و با مواد ته نشین شده بطری مخلوط کنین. مقدار 0/5 میلی لیتر از محلول رو درون یە بطری شیشه‌ای 5 میلی‌لیتری قرار بدین و او رو بمدت 15 دقیقه درون حمام آب با دمای 80 درجه سانتی گراد قرار بدین و پس از گرم کردن، نواری از محلول رو روی پلیت آگار محتوی محیط کشت مناسب قرار بدین. پلیت آگار رو تو دمای 37 درجه سانتی گراد بمدت 72 ساعت آنکوبه کنین و سپس برا وجود کلنیP. larvae  اونو آزمایش کنین.

روش دوم » روش تلقیح مستقیم
هانسن سال 1984برا این کار 5  گرم از نمونه عسل رو تو یە بشر 50 میلی لیتری بریزید و بمدت 5 دقیقه (زمان موثر) درون حمام آب 88 تا 92 درجه سانتی گرادی قرار بدین. پس از گرمادهی، بصورت متوالی و با استفاده از حلقه تلقیح و بصورت ورقه بر روی سه پلیت آگار محتوی محیط کشت مناسب قرار بدین. پلیت ها رو تو دمای 37 درجه سانتی گراد بمدت 72 ساعت آنکوبه کنین و برا وجود کلنی P. larvae مورد آزمایش قرار بدین. این روش میتونە وجود بیش از 2000 اسپور تو هر گرم از عسل P. larvae رو تشخیص بدە.

در حین سادگی و سرعت، تلقیح مستقیم عسل درون پلیت آگار از نظر :
1 - میزان عسلی که می‌توان نمونه گیری نمود
2 - شانس آلوده بودن محدودیت دارە.

روش سوم » دیالیز کردن ( shimanuki & Knox 1988 )
برا بکارگیری آسان تر و کاهش ویسکوزیته، عسل رو تا 45 درجه حرارت بدین تا اجازه داده بشه، اسپورها توزیع یکنواخت تری داشته باشن. 25  میلی لیتر از محلول را درون بشر 50 میلی لیتری قرار بدین و با 10 میلی لیتر آب استریل رقیق کنین، سپس عسل رقیق شده رو توی یە لوله دیالیز 44 میلی لیتری 1/75 اینچی منتقل نمایید. پس از پر کردن لوله، در  اونو ببندین و اونو بمدت 7 تا 8 ساعت درون آب جاری یا حمام آبی که آب اون بایستی طی 3 تا 4 بار طی دوره عوض بشە، غوطه‌ور کنین. تو ادامه تجزیه، مواد درون لوله بمدت 20 دقیقه در حدود 20000G سانتریفوژ میشە. سپس مواد رویی بدقت با یە پی پت برداشته میشە تا حدود یە میلی لیتر از اون باقی بمونە. مواد باقی مانده رو دوباره تو 9 میلی‌لیتر آب درون یک شیشه نمونه با درپوش پیچ‌دار حل کنین و بمدت 10 دقیقە تو دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار بدین تا باکتریهای غیر اسپوری کشته بشن.سپس 0/4 میلی لیتر ازمحلول رو برروی پلیت حاوی آگار BHIT بریزین و پلیت رو بمدت 72 ساعت و تو دمای 24 درجه سانتی گراد برا آزمایش کلنی P. larvae آنکوبه کنین.
از انجایی که حدود 100 اسپور P. larva برا ایجاد رشد قابل مشاهده در BHIT مورد نیاز هستش، در نتیجە این روش میتونە نمایانگر حضور اسپورها تو نمونه‌هایی باشە که دارای حداقل 80 اسپور در هر میلی لیتر عسل تجزیه نشده هستن. تشخیص میزانهای پایین تر اسپور احتمالا با استفاده از مقدار بیشتری از نمونه عسل یا سانتریفوژ مجدد به منظور تجمع اسپورها امکان پذیر باشە. مشکلی که ممکنە گاهی اوقات پیش بیاد، اینە که نمونه عسل حاوی پنی باسیلوس آلودە با سایر باکتریهای اسپوردار باشە که سطح پلیت رو کاملا بپوشونە. هورنیتزکی و کلارک درسال 1991 با اضافه کردن 3 میکروگرم در میلی‌لیتر اسید نالیدیکسیک به محیط کشت بر این مشکل چیره شدن و اونو حل کردن.
برای جستجوی اسپور پنی باسیلوس لاروا تو موم داخل کندو از روش زیر استفادە میکنیم.در ضمینه بازیافت اسپورهایی که از نظر مورفولوژی مشابه اسپورهای P.larvae هستن ، با ذوب کردن موم تو آب جوش، جدا کردن موم پس از سرد شدن و سانتریفوژ G5000 بمدت 20 دقیقه و سپس آزمایش میکروسکوپی مواد ته نشین برا وجود اسپور آقایان Shimanuki و Knox در سال 1988 به موفقیت‌هایی دست پیدا کردن. هچنین اسپورها بااستفاده از عصاره کلروفوم از موم های آلوده بازیافت میشن. به هر حال تو هر دو مورد ، به علت اثر استفاده از تکنیک بازیافت که موجب غیر قابل رشد شدن اسپورها میشە، شناسایی اسپورهای مثبت امکان پذیر نیست.

پکیج تشخیص بیماری لوک آمریکایی، این پکیج شامل اجزا زیر هستش
1 - پی پت
2 - بطری حاوی محلول مخصوص و گوی‌های شیشه‌ای
3 - قاشق برداشت نمونه
4 - پد تشخیص

نحوه کار با این پکیج به این صورتە  که لارو مشکوک به بیماری رو از داخل حجره بوسیله قاشق نمونه برداری برداشته و داخل محلول نمونه برداری میندازیم. سپس بطری حاوی نمونه رو در زاویه 20 درجه خوب بهم می‌زنیم بطوریکه بدن لارو در داخل محلول متلاشی بشە. سپس بوسیله پی پت چند قطره از محلول رو روی، پد در جای مخصوص ریختن نمونه،  می‌ریزیم. اگە دو خط در محل‌های C و T ظاهر شدن کلنی آلوده به بیماری هستش ولی اگە خط فقط در محل C ظاهر بشە کلنی آلوده نیست.

نحوه تشخیص لوک آمریکایی توسط پد مخصوص آن

درمان و پیشگیری
برا درمان ، توقف بيماری و جلوگيري از ظهور مجدد لوك آمريكايي اقداماتي رو تو دو مرحله اجراء میکنیم:
1 - اقدامات مقدماتی
2 - درمان دارویی

در مرحلە اول اقدامات زیر انجام میشە
1 - تدابیر فوری
2 - از بین بردن یا ادغام کردن کلنی های آلودە وضعیف
3 - نابودی توسط شعلە
4 - آمادە سازی جهت ضد عفونی و رفع آلودگی

* اینا اقداماتی هستن کە بایستی تو مرحلە اقدامات مقدماتی بە دقت انجام بگیرن.

تدابير فوري
در اولین قدم درب و دريچه كلني‌های تلف شده بایستی در اسرع وقت برا جلوگيري از غارت بسته بشە.
معاينه كلني‌ها برا تشخيص كلني‌هایی كه بيمار نيستن شروع بشە و کلنی‌های سالم رو سریع از منطقه خارج کرد.

از بين بردن يا ادغام كلني‌هاي آلوده و ضعيف
كلني‌هایی كه جمعيت زنبورای بالغ اونا ضعيفن و نشون میدن كه نمیتونن مقاومت کنن، بوسيله دود گوگرد از بين برده يا با ساير كلني‌های آلوده ادغام بشن. اين كلني‌ها خواهند تونست درمان يا انتقال به كندوی سالم رو تحمل کنن.

نابودي توسط شعله
كلني‌‌هايی که دود گوگرد داده میشن و همچنين كندوهای نامناسب و شفيره‌های آلوده بایستی با شعله نابود بشن.

آماده سازي جهت ضدعفوني و رفع آلودگي
تمام مواد آلوده يا مشكوك به آلودگی مي‌بايست جدا نگهداری بشە و با مواد سالم مخلوط نشن تا ضد عفونی بشن.چون بە شدت واگیر دار بودە و بە شدت بایستی از بە کار بردن اونا اجتناب بشە.

درمان دارويی
اكسی تتراسيكلين (oxytetracycline) یا ترامایسین.
برا هر كلني نيم گرم ماده مؤثره یعنی دارو ، تو يە ليتر يا نيم ليتر شربت 1 به 1 (یعنی ششربتی کە از نسبت یک لیتر آب و یک کیلو شکر تهیە شدە باشە) مخلوط میکنیم و بە اطراف کادر ها میپاشیم.این کار رو سه مرتبه به فاصله يە هفته انجام میدیم.يا اینکە نيم گرم ماده مؤثره رو با 50 گرم پودر شكر مخلوط نموده و بە هر طرف كادرهای زنبوران میپاشیم. ( تكرار این کار هم سه بار به فاصله يە هفته ای هست )

نکات مهم در درمان دارويی
دارو طبق دستور تو شربت سرد يا كمي ولرم، درست هنگام مصرف، با پودر شكر كاملاً مخلوط میشە.  برا پرهيز از باقيماندن دارو تو عسل، درمان بایستی، خارج از زمان شهد دادە  بشە. فراموش نشە كه درمان بعنوان پيشگير هيچ فايده ندارە. آنتي بيوتيك مورد استفاده جلوی رشد فرم فعال باكتری رو میگیرە و روي اسپورها فاقد اثر هستش. بنابراين درمان تو اين زمان يعني با وجود اسپور معني ندارە و همينطور بر آلودگي‌های بعدی كه از بيرون میاد يا آلودگي‌ها مجدد، داخل كندو اثري ندارە.
دکتر ریچارد هاوسمن  (Dr. Richard Houseman)  در کتاب بیماریها و انگل های زنبورعسل(Honey Bee Diseases and Parasites) مینویسە که غوطه ور کردن کندوها و وسایل آلوده در مواد قلیایی میتونه عامل بیماری رو از بین ببرە.
آقای  Rick Fell  تو کتاب بیماریهای زنبورعسل خود یە داروی ضد باکتریایی جدید علیه لوک آمریکایی تحت عنوانTylosin tartrate  معرفی میکنە کە تصویرش رو در زیر آوردیم. این دارو تو 16 نوامبر 2005 برا درمان بیماری لوک آمریکایی تولید شدە. مقدار 200 گرم از دارو رو با 20 گرم شکر مخلوط کرده و تو مدت سه هفته و هر هفته سه بار به کندو خورانده میشە.میزان اثر بخشی دارو بسیار خوب برآورد شده و بعد از چند هفته بهبودی تو کلنی‌ها مشاهده شده.
اخیرا دو داروی دیگە به نامهایPharmasin  و Tylomed-WS برا درمان کلنی‌های آلوده وارد بازار شدن.  بهار سال 2012 داروی جدیدی بنام  Lincomix   جهت استفاده تو کلنی‌های زنبورعسل مورد تائید قرار گرفت. استفاده از مخلوط این دارو با پودر شکر سه بار با فواصل یک هفته ای تو اوائل بهار و یا اواخر پائیز توصیه شدە.

منبع : دکتر مراد خضرزاده